ПЦР на жизнеспособность - Viability PCR

Рабочий процесс ПЦР на жизнеспособность

ПЦР на жизнеспособность, также называемая v-PCR или vPCR, представляет собой эволюцию ПЦР. Используя простую предварительную обработку образца с помощью специальных интеркалирующих фотореактивных реагентов, можно нейтрализовать ДНК мертвых клеток. В результате с помощью ПЦР будет обнаружена только ДНК живых клеток. Такой подход значительно расширяет аналитические возможности процедур ПЦР. Возможность обнаруживать только живые клетки становится очень важной, потому что в ключевых приложениях важнее знать количество живых клеток, чем общий уровень клеток. Примеры этого: контроль качества продуктов питания и воды, диагностика инфекционных заболеваний, ветеринария, экологическая динамика ...

Первое упоминание об этом аналитическом подходе было опубликовано в 2003 году норвежскими исследователями.[1] предлагают использовать моноазид этидия, азидную форму Этидиум бромид, который использовался в других областях аналитики как Проточной цитометрии как кандидат на жизнеспособность ПЦР. Однако основные важные успехи были сделаны Нокером и его коллегами, что продемонстрировано в последующих работах.[2][3][4][5] потенциал этой технологии, а также предложил Моноазид пропидия как лучший реагент для vPCR.[6]

Эта область все еще находится в разработке, с 2003 по 2015 годы научные доказательства применимости vPCR накапливаются, в настоящее время основные усилия сосредоточены на оптимизации процедур. Поскольку простое смешивание реагентов с образцом, фотоактивация и последующая ПЦР не всегда дают ожидаемые результаты, каждая процедура требует некоторой оптимизации. До сих пор основные улучшения заключались в следующем:

- Повышение эффективности фотоактивации: ранние процедуры основывались на использовании галогенных ламп высокой мощности, которые приводили к перегреву образцов и не обеспечивали постоянной световой дозы, эти самодельные решения были заменены приборами на основе светодиодов.[1][2]

- Использование в качестве мишеней длинных апликонов ПЦР.[7]

- Повышение температуры при инкубации в темноте.[8]

За счет комбинирования различных стратегий оптимизации[9] и контролируя аналитическую погрешность, в настоящее время vPCR становится мощным аналитическим инструментом.

Рекомендации

  1. ^ Ногва, Хеге Карин; Drømtorp, Signe Marie; Ниссен, Хильде; Руди, Кнут (1 апреля 2003 г.). «Моноазид этидия для ДНК-дифференциации жизнеспособных и мертвых бактерий с помощью 5'-нуклеазной ПЦР». Биотехнологии. 34 (4): 804–808, 810, 812–813. Дои:10.2144 / 03344rr02. ISSN  0736-6205. PMID  12703305.
  2. ^ Нокер, Андреас; Sossa, Katherine E .; Кампер, Энн К. (2007-08-01). «Молекулярный мониторинг эффективности дезинфекции с использованием моноазида пропидия в сочетании с количественной ПЦР». Журнал микробиологических методов. 70 (2): 252–260. Дои:10.1016 / j.mimet.2007.04.014. ISSN  0167-7012. PMID  17544161.
  3. ^ Нокер, Андреас; Сосса-Фернандес, Присцилла; Burr, Mark D .; Кампер, Энн К. (2007-08-01). «Использование моноазида пропидия для различения живых и мертвых в микробной экологии». Прикладная и экологическая микробиология. 73 (16): 5111–5117. Дои:10.1128 / AEM.02987-06. ISSN  0099-2240. ЧВК  1951001. PMID  17586667.
  4. ^ Нокер, Андреас; Кемпер, Энн К. (01.02.2009). «Новые подходы к преимущественному обнаружению жизнеспособных клеток с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот». Письма о микробиологии FEMS. 291 (2): 137–142. Дои:10.1111 / j.1574-6968.2008.01429.x. ISSN  1574-6968. PMID  19054073.
  5. ^ Нокер, Андреас; Мацца, Альберто; Массон, Люк; Camper, Anne K .; Бруссо, Роланд (2009-03-01). «Селективное обнаружение живых бактерий, сочетающее обработку образцов моноазидом пропидия с технологией микрочипов». Журнал микробиологических методов. 76 (3): 253–261. Дои:10.1016 / j.mimet.2008.11.004. ISSN  0167-7012. PMID  19103234.
  6. ^ Нокер, Андреас; Чунг, Чинг-Инь; Кампер, Энн К. (01.11.2006). «Сравнение моноазида пропидия с моноазидом этидия для дифференциации живых и мертвых бактерий путем селективного удаления ДНК из мертвых клеток». Журнал микробиологических методов. 67 (2): 310–320. Дои:10.1016 / j.mimet.2006.04.015. ISSN  0167-7012. PMID  16753236.
  7. ^ Шнетцингер, Франц; Пан, Ювен; Нокер, Андреас (2013-03-01). «Использование моноазида пропидия и увеличенной длины ампликона снижает количество ложноположительных сигналов в количественной ПЦР для анализа бионагрузки». Прикладная микробиология и биотехнология. 97 (5): 2153–2162. Дои:10.1007 / s00253-013-4711-6. ISSN  1432-0614. PMID  23354451. S2CID  11950879.
  8. ^ Нкуйпу-Кенфак, Эстер; Энгель, Хольгер; Факих, Сара; Нокер, Андреас (2013-04-01). «Повышение эффективности ПЦР на жизнеспособность для селективного обнаружения живых клеток». Журнал микробиологических методов. 93 (1): 20–24. Дои:10.1016 / j.mimet.2013.01.018. ISSN  1872-8359. PMID  23389080.
  9. ^ Фиттипальди, Мариана; Нокер, Андреас; Кодони, Франсеск (01.11.2012). «Прогресс в понимании предпочтительного обнаружения живых клеток с использованием красителей жизнеспособности в сочетании с амплификацией ДНК». Журнал микробиологических методов. 91 (2): 276–289. Дои:10.1016 / j.mimet.2012.08.007. ISSN  1872-8359. PMID  22940102.